ООО "ИННОЛ"

Воздействие пробиотической очистки на микробиотическую экосистему больничных поверхностей 6 часть

mefA

-28,75

-54,15

-103,11

-99,27

msrA

+3,41

+1,13

+2,63

+1,40

oprm

-2,22

-5,90

-3,84

-3,84

tetB

-2,37

-2,96

-4,11

-4,11

mecA

-6,85

-11,52

-10,28

-17,52

S. aureus

-1240,94

-24,38

-88,62

-218,5

spa

-950,70

-404,79

-218,09

-510,25

 

*Результаты выражены в показателях кратности изменения для каждого гена, после нормирования на количество бактериальных ДНК и сравнения со значениями Ct на момент T0.

doi:10.1371/journal.pone.0148857.t002

 

Гены лекарственной устойчивости (исходные бациллы по сравнению с изолятами)

   Исходные PCHS-бациллы   Изоляты бацилл

Ось X: Гены устойчивости

Ось Y: Кратность изменения числа генных копий

 

Рис. 7. Гены лекарственной устойчивости изолятов PCHS-бацилл по сравнению с исходными PCHS-бациллами. ДНК, выделенную из изолятов PCHS-бацилл, собранных с больничных поверхностей, обрабатывали с помощью микрочипа кПЦР, чтобы выявить присутствие 84 генов устойчивости (R­‑генов) к антибиотикам. Результаты выражены как средняя кратность изменения числа генных копий, рассчитанная путем сравнения средних значений, полученных для изолятов бацилл через 1, 2, 3 и 4 месяца после начала обработки по системе PCHS, с соответствующими значениями, полученными для исходных PCHS-бацилл, содержащихся в моющих средствах.

doi:10.1371/journal.pone.0148857.g007

 

В целом, полученные нами результаты свидетельствуют, что PCHS-бациллы заметно уменьшили долю лекарственно устойчивых патогенов в популяции, заражающей поверхности, и при этом не приобрели никакой новой резистентности за период исследования.

Обсуждение результатов

Многочисленные исследования показали, что поверхности в медицинских учреждениях постоянно заражены целым рядом потенциально болезнетворных микроорганизмов и что такое заражение может стать причиной инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, которые являются проблемой во всем мире.

Из-за частых процессов повторного заражения, связанных с присутствием колонизированных пациентов и/или инфицированных посетителей и персонала медицинских учреждений, устранение поверхностного заражения представляет собой очень сложную задачу. Действительно, общепринятые методы, основанные на использовании химических веществ, имеют доказанную эффективность для кратковременного уничтожения большинства патогенов, но не способны предотвратить явления повторного заражения.

Кроме того, большинство клинически значимых патогенов, связанных с ИСПМ, обладают множественной лекарственной устойчивостью, и использование химических веществ может усугубить это явление, вызвав дальнейший рост резистентности тех патогенов, на борьбу с которыми направлены процедуры очистки/дезинфекции. Поэтому, учитывая наблюдаемое в последнее время быстрое распространение мультирезистентных патогенов, срочно необходимы устойчивые и действенные альтернативы используемым сегодня химическим чистящим и дезинфицирующим средствам.

Ранее мы показали, что метод очистки, названный системой гигиены на основе пробиотической очистки (PCHS) и основанный на добавлении в состав моющего раствора штаммов пробиотических бацилл, позволяет эффективно бороться с повторным заражением поверхностей рядом патогенов [24]. В настоящей работе мы проанализировали воздействие этого метода на микробиоту больничных поверхностей с биологической и молекулярной точки зрения, причем нашей главной целью было изучение потенциальной возможности индуцирования/отбора видов, устойчивых к антибиотикам.

Для решения поставленной задачи в медицинском учреждении, где раньше не использовался метод PCHS, в течение 4 месяцев проводили очистку по системе PCHS и оценивали изменения микробиоты с помощью как традиционных микробиологических методов, так и молекулярных методик, позволяющих выявить характеристики резистентности микробной популяции, заражающей поверхности, до начала, в период и после прекращения обработки по системе PCHS. Перед началом испытания новой системы очистки в больничных условиях мы провели лабораторные количественные анализы, которые показали, что споры бацилл, содержащиеся в моющем средстве, используемом в системе PCHS, могут прорастать на неживых поверхностях, образуя вегетативные бактериальные клетки. Через 72 часа после посева такие вегетативные формы составляют почти всю (примерно 80%) популяцию бацилл, а значит, они могут эффективно конкурировать с другими бактериями за пространство и питательные вещества. Благодаря этим свойствам PCHS-бациллы могут вытеснять с обработанных поверхностей другие виды микроорганизмов, о чем свидетельствует увеличение процентной доли бацилл в общей микробиоте в период применения системы PCHS. Действительно, несмотря на частые процессы повторного заражения больничных поверхностей, через месяц популяция бацилл достигла 70% от общего количества микроорганизмов, и в дальнейшем ее доля оставалась стабильно высокой (не менее 60% от общего количества бактерий); это значит, что внесение PCHS-бацилл позволяет ремодулировать микробиоту поверхностей и, тем самым, бороться с явлением повторного заражения. Примечательно, что увеличение доли бацилл сопровождалось значительным уменьшением количества микроорганизмов тех групп, которые ранее существовали на больничных поверхностях: через 4 месяца очистки по системе PCHS уменьшение их количества составило до 99% по сравнению с микробной нагрузкой, выявленной на момент T0, когда применяли только традиционную химическую очистку/дезинфекцию. В противоположность результатам, наблюдавшимся в предыдущих исследованиях [24, 32], обработка по системе PCHS не оказала существенного воздействия на заражение только одной группой патогенов — Enterobacteriaceae spp. Это различие может быть связано с небольшим количеством бактерий группы Enterobacteriaceae на момент T0 (136±26 КОЕ/м2). В отсутствие стойкого начального заражения этими микроорганизмами применение системы PCHS не повлекло за собой значительного изменения КОЕ в последующие моменты времени, а крайне изменчивые показатели КОЕ/м2 на моменты T1 и T3 все же вновь уменьшились и в дальнейшем вернулись к устойчиво низким отметкам, указывая, что воздействие PCHS-бацилл позволяло сохранять их количество на столь низком уровне на протяжении всего исследования.

В связи с наличием данных о сильном воздействии PCHS-бацилл на вид и количество микроорганизмов, обычно заражающих больничные поверхности, мы хотели проверить, может ли обработка по системе PCHS вызвать какую-либо резистентность или отбор резистентных видов, которые могли бы представлять собой негативный побочный эффект этого метода. С этой целью мы исследовали профиль лекарственной устойчивости всей популяции загрязняющих микроорганизмов с помощью микрочипового анализа, позволяющего выявить 84 разных гена устойчивости, чтобы проанализировать резистом загрязняющей популяции. Интересно, что применение моющего средства на основе бацилл не только не привело к индуцированию какой-либо лекарственной устойчивости у поверхностной микробиоты или к отбору лекарственно устойчивых микроорганизмов, но даже снизило ранее существовавшую резистентность, судя по общему уменьшению числа R‑генов (на 1–3 логарифма по сравнению с моментом T0), которые можно обнаружить в микробиоте после очистки по системе PCHS. Кроме того, результаты микрочипового анализа свидетельствуют о значительном уменьшении количества Staphylococci и гена, кодирующего их устойчивость к метициллину, что на молекулярном уровне подтверждает данные, полученные с помощью традиционных микробиологических тестов в рамках настоящего и предыдущих исследований [24, 32].

Вместе с тем, вплоть до окончания исследования мы не выявили приобретения R‑генов у PCHS-бацилл, выделенных с больничных поверхностей после применения данного моющего средства; это позволяет утверждать, что геномы бацилл не подвержены мутагенности или генетическому обмену, о чем свидетельствуют и предыдущие исследования за длительные периоды времени до четырех лет (личные наблюдения). Это наблюдение, вместе с общим уменьшением числа R‑генов в заражающей популяции, также показывает, что, несмотря на тесный контакт бацилл с другими микробными видами, приобретение ими нежелательных характеристик крайне маловероятно, и подтверждает безопасность использования продуктов на основе бацилл. Наиболее важно, что результаты, полученные с использованием трех разных по чувствительности молекулярных тестов, показали полное отсутствие PCHS-бацилл в крови и моче шести пациентов медицинского учреждения (из 159 пациентов, находившихся в стационаре больницы в период исследования), у которых в период применения системы PCHS развилась та или иная ИСМП; это подкрепляет представление о том, что PCHS-бациллы редко являются патогенными даже у ослабленных людей и является аргументом в пользу их возможного применения. Несмотря на эти обнадеживающие результаты, очевидно, необходимы дополнительные исследования с участием большего числа зараженных пациентов. К тому же мы отслеживали состояние зараженных пациентов только в период их госпитализации, тогда как дальнейшие исследования должны также включать контроль за инфекциями после выписки больных. Кроме того, у нас была возможность анализировать только пробы крови и мочи, поскольку никакого специального взятия клинических проб для настоящего исследования не проводилось; между тем, анализ других видов проб пациентов с ИСМП (кожа, раневые культуры, слюна, бронхоальвеолярные выделения и т.д.) значительно повысил бы ценность наших результатов с точки зрения безопасности использования системы PCHS.

Аналогичным образом, будущие исследования выиграли бы от анализа модуляции микробиоты на других поверхностях, к которым часто прикасаются пациенты, в особенности на поверхностях около пациентов, с которым часто контактируют их кожа/руки.

Впервые мы проанализировали весь резистом микробной популяции, заражающей больничные поверхности, и использовали этот подход для мониторинга воздействия метода санитарной обработки на тенденции изменения лекарственной устойчивости. По нашему мнению, данная методология могла бы быть полезной для мониторинга результатов любой процедуры, направленной на уничтожение/контроль патогенных видов, чтобы избежать риска индуцирования/отбора резистентных микробных видов. Кроме того, на основании полученных результатов мы можем предположить, что уменьшение случаев ИСМП могло быть связано со значительным сокращением количества больничных патогенов благодаря обработке поверхностей по системе PCHS и, что еще более важно, что эффективность лечения все же возникающих ИСМП можно было бы повысить также за счет использования лекарственных средств, не применявшихся в последние годы из-за распространения резистентных видов. Эти аспекты заслуживают дополнительного изучения и будут рассмотрены в дальнейших работах.

Выводы

В целом, полученные нами результаты показывают, что штаммы пробиотических бацилл, лучше всего известные как полезные пищевые добавки или фунгициды, также могут успешно применяться в процедурах санитарной обработки, т.к. они препятствуют росту патогенов и, что наиболее важно, сокращают популяцию, несущую гены лекарственной устойчивости, которая является проблемой во всем мире и которая, в конечном итоге, ответственна за вспышки наиболее тяжелых ИСМП.

Более того, за весь период исследования штаммы пробиотических бацилл не приобрели никакой новой лекарственной устойчивости и не были обнаружены ни у одного из пациентов с ИСМП, чьи анализы мы изучали в ходе исследования, а это показывает, что их можно безопасно использовать в процедурах санитарной обработки.

Вспомогательная информация

S1 Fig. Резистом популяции на момент T0. ДНК, выделенную из общей заражающей популяции на момент T0, обрабатывали с помощью микрочипа кПЦР, чтобы выявить присутствие 84 генов устойчивости к антибиотикам. Результаты выражены как кратность различия числа генных копий, рассчитанная путем сравнения значений, определенных на момент T0, с соответствующими значениями, полученными в реакции с отрицательным контролем (NTC). Результаты нормированы на количество бактериальных ДНК.

(TIF)

S2 Fig. Профиль генов устойчивости к противомикробным веществам микробной популяции, заражающей больничные поверхности, на момент T2. ДНК, выделенную из общей численности заражающей популяции, обрабатывали с помощью микрочипа кПЦР, чтобы выявить присутствие 84 генов устойчивости к антибиотикам. Результаты выражены как log10 кратность изменения числа генных копий, рассчитанная путем сравнения значений, определенных на момент T2, через 2 месяца после начала обработки по системе PCHS, с соответствующими значениями, полученными на момент T0 (перед началом такой обработки). Результаты нормированы на количество бактериальных клеток.

(TIF)

S3 Fig. Профиль генов устойчивости к противомикробным веществам микробной популяции, заражающей больничные поверхности, на момент T3. ДНК, выделенную из общей численности заражающей популяции, обрабатывали с помощью микрочипа кПЦР, чтобы выявить присутствие 84 генов устойчивости к антибиотикам. Результаты выражены как log10 кратность изменения числа генных копий, рассчитанная путем сравнения значений, определенных на момент T3, через 3 месяца после начала обработки по системе PCHS, с соответствующими значениями, полученными на момент T0 (перед началом такой обработки). Результаты нормированы на количество бактериальных клеток.

(TIF)

S4 Fig. Профиль генов устойчивости к противомикробным веществам микробной популяции, заражающей больничные поверхности, на момент T4. ДНК, выделенную из общей численности заражающей популяции, обрабатывали с помощью микрочипа кПЦР, чтобы выявить присутствие 84 генов устойчивости к антибиотикам. Результаты выражены как log10 кратность изменения числа генных копий, рассчитанная путем сравнения значений, определенных на момент T4, через 4 месяца после начала обработки по системе PCHS, с соответствующими значениями, полученными на момент T0 (перед началом такой обработки). Результаты нормированы на количество бактериальных клеток.

(TIF)

Благодарности

Настоящее исследование выполнено при финансовой поддержке COPMA scrl (Феррара, Италия). Спонсоры не участвовали в разработке плана исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации и подготовке рукописи. Авторы благодарят персонал больницы «Квизисана» (д‑р П. Коппола, д‑р Э. Чинкини, д‑р М. Мартини, М. Ньяни, О. Дж. Валенсия Серна, Дж. Пьячентини, М. Федоцци) за превосходную готовность к сотрудничеству и техническую помощь.


Размещено: 01.12.2017. Осталось - 360 дней.

Просмотров: 178